01 網織紅細胞計數流式細胞儀法(血液病要做血液檢驗項目有哪些)

網織紅細胞計數

網織紅細胞 Miller;窺盤法;儀器法

Key words:Reticulocyte;Miller ocular;Analyzer

網織紅細胞是骨髓最新被釋放到外周血的成熟紅細胞的前提紅細胞，同成熟紅細胞相比，其細胞內仍殘存小量的RNA（嗜堿性物質），是反映骨髓造血功能的早期指標。目前測定網織紅細胞的自動分析儀主要有：多參數流式細胞儀（FCM），某些全自動血液分析儀，如：Sysmex-R系列分析儀，Miles H3型血液分析儀，Coulter Maxm型分析儀，Abbott CD3500血液分析儀[1,2]。國內多采用顯微鏡目測法。現將Sysmex-R3500分析儀，COULTER MAXM分析儀與Miller窺盤法的測定結果進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)SYSMEX-R3500分析儀：日本希森美康株式會社生產。原裝試劑盒和質控物，批號分別是ZA9004，11130091。(2)COULTER MAXM 分析儀：美國COULTER 公司生產。原裝試劑盒和質控物，批號分別是109155，105379K。試劑盒由試劑A與試劑B組成，其主要成分分別是0.06%新亞甲藍與0.08%硫酸。(3)Miller窺盤法的試劑盒：由TONYAR DIAGNOSTICS.INC生產的ASK BCB Solution，批號A10。成分為焦油藍4 g/L與氯化鈉9 g/L。

1.2 方法

(1)SYSMEX-R3500分析儀測定原理：熒光染料堿性槐黃（或者全胺O）（Auramine O,AO）與網織紅細胞內RNA結合，以氬激光束為光源進行測定。操作步驟：混勻血液，直接測定網織紅細胞。(2)COULTER MAXM 分析儀測定原理：血液標本與新亞甲藍孵育活體染色，加入酸性試劑，使紅細胞內的血紅蛋白溢出，保存被染色的RNA于細胞內，細胞通過測定體積，高頻傳導性以及激光散射（VCS）而進行分析，測定出網織紅細胞。操作步驟：向A管加入4滴與50 μl血液標本，混勻，室溫16℃～30℃放置5 min～60 min.取A管液體2 μl于B管，加入試劑B液2 ml，等30 s，手動進樣檢測。(3)Miller窺盤法原理：煌焦油藍活體染色法。操作步驟：見全國臨床檢驗操作規程。為了重復性好，CV值較低，本次實驗采取了計數500個紅細胞內的網織紅細胞百分數。(4)測定SYSMEX-R3500，COULTER MAXM的批內，批間精密度，并與Miller窺盤法進行比較。分別用SYSMEX-R3500分析儀，COULTER MAXM分析儀與Miller窺盤法對130份正常人標本進行網織紅細胞測定，方差分析統計結果

一位熟練的檢驗工作人員對同一標本用Miller窺盤法重復測定15次，結果如下：均值=1.177 5(0.52～1.89)，S=0.321 9，CV(%)=27.34。

2.7 用SYSMEX-R3500分析儀，COULTER MAXM分析儀，顯微鏡目測法(Miller窺盤法)同時測定130份血常規在正常范圍的標本。結果F=3.87，P<0.05，差異有顯著性。差異性分析(見表6)，相關性分析(見表7)。表6 差異性分析（略）表7 直線相關性分析（略）注：※差異無顯著性，★差異有顯著性，★★差異有極顯著性，△相關。

流式細胞技術的發展趨勢

當前，臨床流式細胞分析已成為檢驗醫學發展的一個熱點，其發展趨勢主要體現在以下幾個方面。

一．從相對細胞計數到絕對細胞計數

流式細胞分析最大的優點是對混合細胞群體中亞群細胞的計數，如淋巴細胞可依其表面標志的不同分為T淋巴細胞（CD3+）、B淋巴細胞（CD19+）、NK細胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細胞又可進一步分為輔助/誘導T淋巴細胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/細胞毒T淋巴細胞（CD3+CD4-CD8+）等。這些亞群細胞計數過去多以相對百分比表達結果，由于百分比只能代表每種細胞在混合細胞群體中所占的比例，并不能體現其在單位體積血液中的絕對數量，而對艾滋病等一些疾病的臨床診斷，有時需要考慮細胞的絕對數量，如患者血液中T輔助/誘導細胞（CD3+CD4+CD8-）的數量<200個/μL，而未發病（僅有HIV感染）者的數量>200個/μL。T淋巴細胞亞群的絕對計數在國外實驗室早已成為常規檢查，但在國內僅有少數實驗室開展。可以預見，隨著干細胞技術的發展，對造血干細胞等的絕對數量分析，不久的將來，也將作為常規檢查項目，走出實驗室進入臨床。

流式細胞絕對計數在臨床可開展的項目包括：①淋巴細胞亞群，尤其是T淋巴細胞亞群的絕對計數。②外周血或骨髓中造血干/祖細胞的絕對計數。③血液中網織紅細胞的絕對計數。④血液中血小板數量，尤其是血小板減少癥患者血小板的絕對計數，此種計數優于血細胞分析儀法，已成為血小板計數的國際推薦參考方法。此外，可能出現在血液中的其它一些稀少細胞（如內皮細胞、轉移的腫瘤細胞等）的計數，也將發展為流式細胞絕對計數。流式細胞絕對計數的開展對臨床疾病的診斷、治療等有重要意義。

二．從相對定量到絕對定量分析

細胞的多種成分如某些抗原或受體表達的流式細胞分析，以前多以平均熒光強度（MFI）或相對熒光強度（RFI）表達其含量。由于流式細胞儀每次的儀器狀況可出現差異，每個實驗室所用儀器的類型也不盡相同，因此，以MFI或RFI表示細胞抗原或受體的表達量缺乏可比性，雖然流式細胞儀有極高的熒光靈敏度，但卻無法準確應用這些信息。近年來，為了通過FCM精確定量分析細胞的某些成分，定量流式細胞術（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐漸得到發展，其定量分析原理主要有兩種：①定量抗體微球法：在特制的微球上包被已知分子數的羊抗鼠IgG分子，再將包被不同分子數的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子數的混合微球，此微球與待測標本在相同條件下與熒光素標記的單克隆抗體（McAb）反應后在流式細胞儀上測定其熒光強度，根據微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數和與之對應的對數熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本中陽性細胞的對數熒光強度代入方程即可求得其每個細胞上的平均抗原分子數（抗原結合位點數）。②定量熒光素分子微球法：在特制的微球上直接包被熒光素分子，再將包被不同分子數的微球混合，形成含不同數量熒光素分子的混合微球。在流式細胞儀儀器設置相同的條件下測定此微球及待測細胞的熒光強度，根據微球上所包被的熒光素分子數和與之對應的對數熒光強度計算回歸方程，再將待測樣本陽性細胞的對數熒光強度代入方程，可求得每個細胞上的平均熒光素分子數，根據用于樣本測定的單克隆抗體（McAb）與熒光素結合的分子比例，計算每個細胞上的平均抗原分子數。單細胞的抗原或受體定量是流式細胞分析的重要進展，為細胞的生物學、分子生物學、生物化學及免疫學等研究提供了更精確的方法。例如，白血病原始細胞膜的CD45分子表達量低于正常淋巴細胞，活化血小板膜CD62P、CD41分子數顯著高于靜止血小板，活化淋巴細胞的CD69分子數顯著增高，活化中性粒細胞膜CD64分子數顯著高于靜止中性粒細胞，強直性脊柱炎患者T淋巴細胞膜HLA-B27分子數明顯增高。CD8+T淋巴細胞膜的CD38分子數增高是慢性HIV感染者病情發展或死亡的更有力的預后指標；AIDS治療有效后，CD8+T淋巴細胞CD38分子數顯著降低。

三．從單色到多色熒光分析

流式細胞分析已從最初的間接免疫熒光染色、單色或雙色直接熒光染色，迅速發展到三色、四色甚至五色或六色熒光分析，使得對細胞亞群的識別和分選、細胞功能評價等更為精確。目前，淋巴細胞亞群的分析、白血病免疫表型分析，均應使用至少三色以上的熒光分析才更可靠。例如：輔助/誘導T淋巴細胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細胞白血病的異常淋巴細胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+。多色熒光分析是流式細胞技術發展的必然趨勢，有條件時應盡可能地采用。

四．從細胞膜成份到細胞內成份分析

細胞膜免疫表型分析是最重要的流式分析內容之一，很多細胞亞群的檢測和分選均是以細胞膜的免疫表型特征為依據，如T、B淋巴細胞和NK細胞分析、白血病免疫分型等。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的，尤其對一些細胞的系列鑒定和功能狀態分析常常較為困難，而細胞漿或細胞核內成份的分析則更能反映某些細胞的系列特征和功能變化。隨著近年來細胞內成分檢測技術的不斷完善，細胞內成分檢測已成為流式細胞分析的又一個熱點。例如，急性髓系白血病性原始細胞漿中檢測到髓過氧化物酶（MPO）是最為準確的系列標志，急性B淋巴細胞白血病性原始細胞胞漿中檢測到CD79a是最為特異的系列標志；檢測T淋巴細胞胞漿內細胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達，是判斷T淋巴細胞活化及其功能的重要手段，而且還能將輔助/誘導T淋巴細胞（Th）進一步分成Th1和Th2亞類，在Th1和Th2細胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通過細胞內成分檢測技術與多色免疫熒光分析方法相結合，可檢測不同細胞亞群合成的不同細胞因子（Cytokine），如用五色疫熒光分析血液中淋巴細胞經誘導劑刺激后，輔助/誘導T淋巴細胞亞類—Th1細胞內有細胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。

五．液體中可溶性成分的流式細胞分析

從傳統意義上講，流式細胞技術只能分析細胞及其成分，液體中的可溶性成分則不能進行分析。然而，如果將液體中的可溶性成分結合在一種類似于細胞大小的顆粒（如乳膠顆粒）上，流式細胞儀便可以對其進行分析，這就是近年來發展起來的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技術。CBA的原理是將包被某種抗原或抗體不同大小的微球與待測液體中的相應成分反應形成抗原與抗體的復合物，再加入熒光素標記的第二抗體，微球上結合的待測抗原或抗體分子數量與其熒光強度呈線性關系，由此可對待測液體中與微球上包被抗原或抗體分子相對應的成分進行定性或定量分析，例如同時測定血清或細胞培養液中的多種細胞因子，同時測定血清中多種自身抗體。CBA發展的時間雖很短，目前所能檢測的項目還不多，但其發展潛力不容忽視。已知檢測細胞因子的方法有多種，包括靶細胞功能分析法、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、斑點酶免疫分析（Elispots）等，但CBA與之相比，其靈敏度極高、可達2pg/ml，而且能同時測定單個標本中的多種細胞因子。

六．分子表型分析

分子表型分析（Molecular Phenotyping）是指用流式細胞技術檢測細胞中特異性核酸序列或特異性基因異常。流式分子表型分析與免疫表型分析技術相結合，為所選擇細胞亞群的特異性核酸序列（如癌基因、病毒核酸等）檢測提供了一種非常有用的工具，具有廣闊的應用前景。流式分子表型與免疫表型分析結合的基本技術路線是：①待測細胞首先與特異性細胞亞群的單克隆抗體反應，②固定并滲透細胞，③通過PCR進行引物特異的核酸序列擴增，④應用對擴增產物的特異性寡核苷酸熒光素標記探針進行熒光原位雜交（FISH），⑤加入針對細胞亞群單抗的熒光素標記的第二抗體。⑥流式細胞儀檢測及數據分析。例如，流式細胞免疫表型與聚合酶鏈反應及熒光原位雜交（PCR-FISH）結合測定血液CD4+細胞中HIV特異的DNA或RNA，對于AIDS的病程監

很赞哦!（6）