02 流式細胞儀檢測網織紅細胞的參數有(HBL27是什么意思啊)

子生物學研究。

8 常規檢測時的樣品制備 8.1 直接免疫熒光標記法

取一定量細胞（約1×106 細胞/ml），直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應（如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入），孵育20～60分鐘后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入緩沖液重懸，上機檢測。本方法操作簡便，結果準確，易于分析，適用于同一細胞群多參數同時測定。雖然直標抗體試劑成本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標本的檢測。

8.2 間接免疫熒光標記法

取一定量的細胞懸液（約1X106 細胞/ml），先加入特異的第一抗體，待反應完全后洗去未結合抗體，再加入熒光標記的第二抗體，生成抗原抗體抗抗體復合物，以FCM檢測其上標記的熒光素被激發后發出的熒光。本方法費用較低，二抗應用廣泛，多用于科研標本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結果。所以標本制備時應加入陰性或陽性對照。另外，由于間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數較少的標本。

9 質量控制和注意事項

流式細胞儀并非是完全自動化的儀器，準確的實驗結果還需要準確的人工技術配合，所以標本制備需要規范，儀器本身亦需要質量控制。

9.1 流式細胞術免疫學檢測的影響因素和質量控制

流式細胞術在免疫學中有著廣泛的應用，其免疫熒光染色的標本制備非常重要，常常由于標本制備過程中出現人為非特異性熒光干擾(尤其在間接免疫熒光染色中)或細胞濃度低等影響檢測結果。解決這些影響因素的方法如下：

(1) 確保標本上機檢測前的濃度為1X106/ml，細胞濃度過低直接影響檢測結果。

(2) 使用蛋白封閉劑，封閉非特異結合位點，尤其在間接免疫熒光標記時必不可少。常用的蛋白封閉劑為0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。

(3) 熒光抗體染色后充分洗滌，注意混勻和離心速度，減少重疊細胞和細胞碎片。

(4) 設置對照樣品，采用與抗體來源同型匹配的無關對照和熒光抗體的本底對照。

(5)判定結果時，應注意減去本底熒光，為使免疫熒光的定量分析更精確，應用計算機程序軟件，用擬合曲線方法從實驗組的曲線峰值中減去對照組的曲線峰值，可以得到更準確的免疫熒光定量結果。

(6) 注意染色后避光，保證細胞免疫熒光的穩定。

9.2 DNA倍體分析的質量控制

DNA倍體分析的質量控制仍沒有統一的標準， 各文獻報道的實驗結果差異較大，1993年10月美國癌癥研究組織制定了FCMDNA定的統一標準，我們根據這些標準并結合國內有經驗的專家多年的實踐，對FCM的DNA分析技術的質控和注意事項進行說明。

(1) 手術切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時，要避免出血壞死組織。

(2) 標本采集后要及時固定或深低溫保存，以免組織發生自溶，DNA降解，而造成測試結果的誤差。

(3) 固定劑要采用對組織細胞穿透性強的濃度，70%的乙醇固定效果較好。

(4) 單細胞懸液制備過程中，注意將待測細胞成分分離出來，減少其他成分的干擾，并注意不要損傷該群細胞。

(5) 細胞樣品的采集要保證足夠的細胞濃度，即1X106/ml，雜質、碎片、團塊和重疊細胞應<2%，對腫瘤細胞DNA異倍體的分析樣品，至少有20%的腫瘤細胞存在。

(6) 石蠟包埋組織單細胞制備時要注意：取材時應選取無自溶、壞死的組織，對腫瘤組織標本，選取含腫瘤細胞豐富的區域；石蠟組織片的厚度要適宜，最好為40～50μm 。過薄或過厚的切片均會影響檢測結果；徹底脫蠟，以免殘留的石蠟影響酶的消化活性，驗證脫蠟是否完全的方法是棄去二甲苯，加入100%乙醇，如果無絮狀物浮起，說明蠟已脫凈；水化要充分，使組織還原到與新鮮組織相似的狀態；注意消化的時間和消化酶的活性。常規使用0.5%胃蛋白酶，pH 1.5。

9.3 操作

(1)流式細胞儀在整個工作過程中處于最佳狀態，能保證定量檢測的準確性和檢測精度。使用標準樣品調整儀器的變異系數在最小范圍，分辨率在最好狀態，能避免在測量過程中儀器條件的變化引起的檢測誤差。

(2)評價儀器精度的重要指標是儀器的變異系數（CV），對于校準樣品，其CV值越小越好，CV值越小，說明儀器校正的精度越高。校準樣品包括非生物樣品（熒光微球）和生物細胞樣品（人淋巴細胞、雞紅細胞等）。目前，非生物熒光微球已有商品試劑，CV一般<2%～3%。

9.4 資料分析

(1) 當樣品中碎片雜質或團塊過多，所測細胞數在20%以下，組方圖的基線抬高時，應放棄分析處理。

(2) 做細胞周期分析時，樣品細胞數應在1萬個，排除碎片、雜質和團塊，當異倍體細胞數占總細胞數10%以下時，需要結合其他診斷指標，不可盲目下結論，至少異倍體細胞占總細胞數的20%以上，可以確定異倍體的存在。

(3)DNA分析時，正常二倍體細胞組方圖CV值>8%時放棄分析，但腫瘤細胞的CV值>8%，與腫瘤細胞的異質性有關。另外，DNA倍體分析時，同源組織的不同個體會出現10%的漂移。

流式細胞術的應用范圍

隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經從科學研究走入了臨床應用 階段，在我國臨床醫學領域里已有著廣泛的應用。可用于白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定，以及免疫學研究，并已開始用于細菌鑒定，病毒感染細胞的識別和艾滋病感染者T4、T8細胞的記數。

自70年代以來，隨著流式細胞技術水平的不斷提高，其應用范圍也日益廣泛。流式細胞術已普遍應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫學和基礎醫學研究領域。

在腫瘤學中的應用

這是FCM在臨床醫學中應用最早的一個領域。首先需要把實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液，用熒光染料(碘化吡啶PI)染色后對細胞的DNA含量進行分析，將不易區分的群體細胞分成三個亞群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表細胞的倍體狀態，非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。

(1)發現癌前病變，協助腫瘤早期診斷：人體正常組織發生癌變要經過一個由量變到質變的漫長過程，而癌前細胞即處于量變過程中向癌細胞轉化階段。人體正常的體細胞均具有比較穩定的DNA二倍體含量。當人體發生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時，在其發生、發展過程中可伴隨細胞DNA含量的異常改變，FCM可精確定量DNA含量的改變，作為診斷癌前病變發展至癌變中的一個有價值的標志，能對癌前病變的性質及發展趨勢作出估價，有助于癌變的早期診斷。有資料證實，癌前病變的癌變發生率與細胞不典型增生程度有密切關系，增生程度越重，癌變發生率越高。隨著細胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍體出現率增高，這是癌變的一個重要標志。

(2)在腫瘤的診斷、預后判斷和治療中的作用：FCM在腫瘤診斷中的重要作用已經被認可，DNA非整倍體細胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力的依據，FCM分析病理細胞具有速度快、信息量大，敏感度高等優點，已被用在常規工作中。腫瘤細胞DNA倍體分析對病人預后的判斷有重要作用，異倍體腫瘤惡性病變的復發率高、轉移率高、死亡率也高，而二倍體及近二倍體腫瘤的預后則較好。

FCM不僅可對惡性腫瘤DNA含量進行分析，還可根據化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效，了解細胞動力學變化，對腫瘤化療具有重要的意義。臨床醫師可以根據細胞周期各時相的分布情況，依據化療藥物對細胞動力學的干擾理論，設計最佳的治療方案，從DNA直方圖直接地看到瘤細胞的殺傷變化，及時選用有效的藥物，對瘤細胞達到最大的殺傷效果。

此外FCM近幾年還被應用于細胞凋亡和多藥耐藥基因的研究中[3，4]。醫學工作者開始研究如何用藥物誘導癌細胞死亡。通過對細胞體積、光散射、DNA含量及特異性抗原基因(如bcl-2, Fas等)測定分析出細胞凋亡情況。多藥耐藥是腫瘤病人化療失敗的主要原因，FCM對多藥耐藥基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定，可為臨床治療效果分析提供有力依據。

在臨床中的作用

FCM通過熒光抗原抗體檢測技術對細胞表面抗原分析，進行細胞分類和亞群分析。這一技術對于人體細胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治療有重要作用。有大量文章介紹了淋巴細胞亞群等在各種疾病中的變化。正常人群淋巴細胞T4/T8比值大約為2∶1，但在人體細胞免疫力低下時可出現比例倒置。用FCM還可以監測腎移植后病人的腎排斥反應，如果T4/T8比例倒置，病人預后良好，較少發生腎排異現象；反之排異危險性增加。同樣此種測定技術也用于艾滋病的診斷和治療中。還有作者報告了外周血淋巴細胞免疫表型的參考值，并對其種族、性別、年齡等影響因素進行了探討[5]。

目前FCM用的各種單克隆抗體試劑已經發展到了百余種，可以對各種血細胞和組織細胞的表型進行測定分析。

在血液病診斷和治療中的應用

FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對各種血液病的診斷、預后判斷和治療起著舉足輕重的作用。

(1)白血病的診斷和治療：FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原(CD)的單克隆抗體，借助于各種熒光染料(異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等)測定一個細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種急性白血病的診斷和鑒別診斷有決定性作用[6]。例如干細胞表達CD34，髓系表達CD13、CD14，B細胞系表達CD10、CD19、CD20等，T細胞系表達CD2、CD3、CD5、CD7，利用FCM可以測定出血細胞表達各種抗原的水平，協助臨床確診。

同其它腫瘤的治療一樣，測定DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應藥物可以提高療效。

目前臨床除化療藥物治療外還采用造血干細胞移植技術治療急性白血病和一些疑難性疾病[7]。FCM通過對人白細胞抗原(HLA)配型的測定可以為異體干細胞移植病人選擇出最合適的供體。造血干細胞移植技術主要包括干細胞的鑒別、活性測定、干細胞動員和采集、分離純化、保存擴增、腫瘤細胞的凈化、干細胞回輸以及術后保持移植物抗宿主病的低發生率等一系列過程。FCM測定CD34、HLA-DR、CD33等細胞表面標志物，成為干細胞移植技術重要的監測手段。用FCM檢測一系列指標觀察病人的恢復狀態，可以對預后做出早期的判斷。

(2)其它種類血液病的診斷和治療監測：陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥是一種造血干細胞克隆病，細胞CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。該抗原屬于血細胞表面磷脂酰肌醇錨連蛋白家族，是重要的補體調節蛋白，它通過與補體C8、C9的結合以阻止補體膜攻擊復合物的形成，從而抑制細胞被補體激活溶解。FCM采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞CD59的表達做定量分析，可以協助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度[8]。

(3)網織紅細胞的測定及臨床應用：網織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標，FC

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