03 流式細胞儀檢測網織紅細胞的參數(流式細胞術的應用范圍)

果的分布即可用均值和標準差來描述。這就意味著95.5%的結果在x+2s范圍內,99.7%的結果在x+3s范圍內。為便于觀察質控結果，及時了解有何失效情況，常使用質控圖。

按照正態分布規律：1)所有測定值應均勻分布于均值兩側，不應有明顯不均之感；2)質控品測定值應有95.5%的可能性在x±2s范圍之內； 3)不應有連續6次以上的結果落于平均值的一側；4)不能有連續5次以上的結果有逐漸增高或降低的趨勢性變化;5)不應有連續兩次結果在x±2s范圍之外； 6)沒有一次結果在x±3s范圍之外。

如果不符合上述規律，則說明結果失控。只有證實當天質控結果在控制之內,對當天的臨床檢驗才能發出結果。一旦出現失控,則須查明原因，重新檢驗。對有1次檢驗結果超出均數2個標準差范圍，提示警告。同批實驗中2個質控品的結果之差值超過4s，也是失控規則之一，提示存在隨機誤差。連續4次質控結果同方向超出均數1個標準差范圍，也是失控規則之一，提示存在系統誤差。

五、室間質量評價

開展內部的質量控制使實驗的受控項目達到一定的精密度。臨床上往往只對實驗結果是否可重復較敏感，若實驗結果存在較穩定的系統誤差，臨床和實驗室一般不易察覺，因此內部的質量控制還在于控制結果的不精密度。由專門機構定期向臨床實驗室分發質控品,要求各單位檢測后返回測定結果，經過整理和統計，以數據和報告形式反映各實驗室間及各分析方法間的差異，根據各單位測定結果與靶值的離散程度，計算出該實驗室所的分數，及時反饋給參加者，便于改進工作。這就是室間質量評價的基本形式。室間質量評價主要是控制實驗室工作的不準確度，是對室內質量控制的補充。我國于2000年，由衛生部臨床檢驗中心開始組織開展臨床流式細胞術室間質評。現已開展了T細胞亞群檢測和CD34絕對計數的室間質評。

流式細胞術簡介

目錄 1 拼音 2 英文參考 3 流式細胞術發展簡史 4 工作原理 5 檢測范圍 6 流式細胞術的臨床應用 7 科研應用 8 常規檢測時的樣品制備 8.1 直接免疫熒光標記法 8.2 間接免疫熒光標記法 9 質量控制和注意事項 9.1 流式細胞術免疫學檢測的影響因素和質量控制 9.2 DNA倍體分析的質量控制 9.3 操作 9.4 資料分析 1 拼音

liú shì xì bāo shù

2 英文參考

flow cytometry

流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是七十年代發展起來的高科學技術,它集計算機技術、激光技術、流體力學、細胞化學、細胞免疫學于一體, 同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內DNA、RNA含量等,在血液學、免疫學、腫瘤學、藥物學、分子生物學等學科廣泛應用。

3 流式細胞術發展簡史

流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是一種可以對細胞或亞細胞結構進行快速測量的新型分析技術和分選技術。其特點是：①測量速度快，最快可在1秒種內計測數萬個細胞；②可進行多參數測量，可以對同一個細胞做有關物理、化學特性的多參數測量，并具有明顯的統計學意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術、計算機技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等從多領域的知識和成果；④既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。

概要說來，流式細胞術主要包括了樣品的液流技術、細胞的分選和計數技術，以及數據的采集和分析技術等。FCM目前發展的水平凝聚了半個世紀以來人們在這方面的心血和成果。

1934年，Moldavan1首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數，并用光電記錄裝置計測的設想，在此之前，人們還習慣于測量靜止的細胞，因為要使單個細胞順次流過狹窄管道容易造成較大的細胞和細胞團塊的淤阻。1953年Crosland –Taylor根據雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規律的研究認識到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流體動力聚集作用。于是設計了一個流動室，使待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍著鞘液；細胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現代流式細胞術中的液流技術基礎。

1956年，Coulter在多年研究的基礎上利用Coulter效應生產了Coulter 計數器。其基本原理是：使細胞通過一個小孔，只在細胞與懸浮的介質之間存在著導電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖的強度和個數則可獲得有關細胞大小和數目方面的信息。1967年Holm等設計了通過汞弧光燈激發熒光染色的細胞，再由光電檢測設備計數的裝置。1973年Steinkamp設計了一種利用激光激發雙色熒光色素標記的細胞，既能分析計數，又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現代FCM計數技術的主要歷程。

現代的FCM數據采集和分析技術是從組織化學發源的，其開拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在組織化學的基礎上提出了兩個新設想：（1）細胞的組分是可以用光光度學來定量測定的，即分光光度術可以定量地獲得有關細胞組織化學的重要信息。（2）細胞的不同組分可以同時進行多參數測量，從而可以對細胞進行分類。換句話說，對同一細胞可以同時獲得有關不同組分的多方面信息，用作鑒別細胞的依據。Kamentsky不僅思路敏捷，而且能身體力行。他是第一個把計算機接口接到儀器上并記錄分析了多參數數據的人，也是第一個采用了二維直方圖來顯示和分析多參數的人。

流式細胞術在細胞化學中的應用的先驅者是Van Dilla和美國的Los Alamos小組。他們在1967年研制出流液束、照明光軸、檢測系統光軸三者相互正交的流式細胞計的基礎上，首次用熒光Feulgen反應對DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關系，并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細胞周期的各個時相。Gohde 和Dittrich接著把這項技術推向實用，他們用流式細胞術測定細胞周期借以研究細胞藥代動力學問題。FCM用于免疫組織化學中的關鍵是對細胞進行免疫熒光染色，其它和在細胞化學的應用并沒有多大差異。

近20年來，國內外在FCM上都做了不少的研究和應用工作，也取得了不少成果。特別是隨著儀器和方法和日臻完善，人們越來越致力于樣品制備、細胞標記、軟件開發等方面的工作以擴大FCM的應用領域和使用效果。FCM在免疫組織化學中的應用也大致差不多，并注重了在臨床應用的推廣。

4 工作原理

流式細胞術

將待測細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室，不含細胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區域。

流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小；熒光信號的接受方向與激光束垂直，經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。

這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度，經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過模／數轉換器，將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理，將分析結果顯示在計算機屏幕上，液可以打印出來，還可以數據文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。

檢測數據的顯示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達，其X軸為測量強度，Y軸為細胞數目。一般來說，流式細胞儀坐標軸的分辨率有512或1024通道數，這視其模數轉換器的分辨率而定。對于雙參數或多參數數據，既可以單獨顯示每個參數的直方圖，也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。

細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現細胞的分離。

5 檢測范圍

1．流式細胞儀可以檢測細胞結構，包括：細胞大小、細胞粒度、細胞表面面積、核漿比例、DNA含量與細胞周期、R NA 含量、蛋白質含量。

2．流式細胞儀可以檢測細胞功能，包括：細胞表面/ 胞漿/ 核的特異性抗原、細胞活性、細胞內細胞因子、酶活性、激素結合位點和細胞受體。

6 流式細胞術的臨床應用

1．流式細胞術在腫瘤學中的應用：流式細胞術可以檢測腫瘤細胞增殖周期、檢測腫瘤細胞表面標記、癌基因表達產物、進行多藥耐藥性分析、檢測凋亡；

2．流式細胞術在血液學中的應用：檢測白血病和淋巴瘤細胞、活化血小板、造血干細胞（CD34+）計數、白血病與淋巴瘤的免疫分型、網織紅細胞計數、細胞移植的交叉配型和免疫狀態監測；

3．流式細胞術在免疫學中的應用：可以進行淋巴細胞及其亞群分析、淋巴細胞免疫分型、檢測細胞因子。

7 科研應用

主要有細胞動力學功能研究、環境微生物分析、流式細胞術與分子生物學研究。

8 常規檢測時的樣品制備 8.1 直接免疫熒光標記法

取一定量細胞（約1×106 細胞/ml），直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應（如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入），孵育20～60分鐘后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入緩沖液重懸，上機檢測。本方法操作簡便，結果準確，易于分析，適用于同一細胞群多參數同時測定。雖然直標抗體試劑成本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標本的檢測。

8.2 間接免疫熒光標記法

取一定量的細胞懸液（約1X106 細胞/ml），先加入特異的第一抗體，待反應完全后洗去未結合抗體，再加入熒光標記的第二抗體，生成抗原抗體抗抗體復合物，以FCM檢測其上標記的熒光素被激發后發出的熒光。本方法費用較低，二抗應用廣泛，多用于科研標本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結果。所以標本制備時應加入陰性或陽性對照。另外，由于間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數較少的標本。

9 質量控制和注意事項

流式細胞儀并非是完全自動化的儀器，準確的實驗結果還需要準確的人工技術配合，所以標本制備需要規范，儀器本身亦需要質量控制。

9.1 流式細胞術免疫學檢測的影響因素和質量控制

流式細胞術在免疫學中有著廣泛的應用，其免疫熒光染色的標本制備非常重要，常常由于標本

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