03 網織紅細胞計數流式細胞儀法(血液病要做血液檢驗項目有哪些)

3、鞘流技術（sheath flow）：為了避免計數中血細胞從小孔邊緣處流過及湍流、渦流的影響，發明了鞘流技術

具體做法是用一毛細管對準小孔管，細胞混懸液從毛細管噴出，同時與四周流出的鞘液一起流過敏感區，保證細胞混懸液在中間形成單個排列的細胞流，四周被鞘液圍繞

鞘流技術可應用于兩種細胞計數原理：一為電阻抗原理，鞘流通過小孔的敏感區進行細胞計數；另一種為激光計數原理，細胞液流室較長，與激光垂直相交，激光光束對流經的每一個細胞照射后產生光散射，利用此原理進行細胞計數

4、浮動界標：正常標本中紅細胞與血小板體積相差較大，一般將紅細胞與血小板的界限定于35fl，大的為紅細胞，小的為血小板，也有以30fl或20fl為界限的

但在某些病理情況下可能有大血小板超過35fl界限，造成血小板漏計使結果偏低；反之，如果紅細胞體積偏小（如缺鐵性貧血、地中海性貧血），則可能將部分小紅細胞誤計為血小板，使血小板計數偏高

為了結果準確一些，計數儀利用計算機在5-35fl間尋找直方圖最低點，以此定為紅細胞和血小板的界限

由此可使所計數的數值符合實際情況

因為各種細胞間的界限可以隨細胞實際大小而向左或右移動，故稱為浮動界標技術（floating threshold）

此外，還有延時計數（extended 買粉絲unt）、擬合曲線（fitting curve）等技術以確保計數結果和體積分布圖的準確性

三、白細胞計數及分類在早期的單分類儀器中，WBC的計數是將病人的血樣經抗凝后按一定比例稀釋，再加入溶血劑（作用是使細胞膜皺縮，周圍的胞漿慢慢從細胞內擴散，但細胞顆粒仍在），使經過這樣預處理的病人血樣成為有懸浮顆粒的液體，并使其在一定時間內流過一個用紅寶石做成的微孔

不同的顆粒可用不同大小的微孔來測試，一般情況下測量白細胞的微孔尺寸長*直徑為100*70微米左右

后來，許多公司在單分類儀器的基礎上利用經過溶血處理后的白細胞體積大小不同，將產生大小不同的電脈沖，通過儀器內電腦的各個通道運算可初步確認相應的細胞參數，將細胞分成淋巴細胞（小細胞亞群）、中性細胞（單核細胞亞群）和粒細胞群（大細胞亞群）三個分類計數

由于采用液流聚焦電阻法克服了微孔易堵、液體返流等問題，采用了定容積方法來克服由于負壓不穩引起的誤差，并將樣本稀釋、添加溶血劑等多道手續在機內一次完成，提高了自動化程度

在電路上，還在通道中對多個顆粒同時進入微孔敏感帶而造成的誤差進行自動校正，數據經CPU處理后在顯示器、打印機上用數據圖表、直方圖等形式讀出，儀器軟件提供人機對話界面，能方便地完成定標、質控、測量、沖洗等日常操作，報告參數有近20項

此類儀器由于結構和電路上都較單分類儀器作了較大改進，性能穩定，在中小醫院得到了廣泛使用

近期血細胞分析儀測試原理的改進，主要體現在白細胞分類方面的改進

對WBC來說，從單分類到三分類、五分類甚至九分類，血細胞的測定和分析方法已經不僅僅局限于某一單一的方法，已發展到利用多種物理化學方法處理白細胞，用先進的電腦技術區分、辨別經上術方法處理后的各細胞間的細胞差別，綜和分析實驗數據，得出較為準確的白細胞分群結果

聯合檢測法代表了血細胞分析儀的最新發展趨勢

如庫爾特公司的STKS和GEN

S采用電阻抗、激光及電磁波技術，拜爾公司的ADVIA系列采用化學反應與激光技術結合原理進行白細胞五分類測定，雅培公司的CD-3500采用電阻抗與光散射結合技術,希森美康公司的XE-2100/SE-9500用硫化氨基酸和特殊溶血劑及電阻抗與射頻技術檢測幼稚細胞等，這些儀器的問世大大提供了自動化儀器進行白細胞分類的準確性，使儀器的發展進入了新階段

下面就各大廠家對白細胞的分類采用的各種不同方法做些介紹

1、 Coulter公司的VCS聯合檢測技術VCS技術即體積測量、高能電磁波傳導性和激光散射技術（見原理圖1）

V代表體積

Coulter公司仍采用電阻抗法進行血細胞計數和體積測量

C代表一束電磁波穿透細胞的傳導性，它取決于細胞的大小及內部結構

通常我們用較正后的傳導性來反映細胞的內部結構，如核的大小、核漿比例及細胞內質粒的大小和密度，所以傳導性可辨別體積完全相同的兩組細胞群

例如直徑均在9-12um的小淋巴細胞和嗜堿性粒細胞

S代表光散射，可以依據細胞表明光散射的特點對細胞進行分類

用激光光源產生的單色光束直接進入計數池的敏感區，在不同角度（10°～70°）對每個細胞進行掃描分析，測定其散射光強度，從而提供細胞結構、形態的光散射信息

由于粗顆粒細胞的散射強度比細顆粒細胞更強，故光散射對細胞顆粒的構型和顆粒質量具有很好的區別能力

圖1、VCS法白細胞分類原理 VCS技術可使白細胞處于與機體完全相同的自然條件下得出檢驗結果

首先在樣本內加入只作用于紅細胞的溶血劑（erythrolya）使紅細胞溶解，然后加入抗溶血劑（stabilyse）起中和溶血劑的作用，使白細胞表面、胞質及細胞大小等特點仍保持與體內相同的狀態，由于不同的細胞在細胞體積、表面特征、內部結構如核漿比例和顆粒構型及質量等方面完全一致的幾率很小，加上儀器配備了先進軟件，可與流式細胞儀一樣調較，設置門限，可在三維圖像上將各細胞較好的分開，達到較準確的分類，同時可提示幼稚白細胞、異型淋巴細胞等

此外，還可將包被了抗CD4和CD8單克隆抗體的聚苯乙烯微球加到血液中，使含有相應表面（抗原）標志的淋巴細胞結合相應的微球而改變該細胞的VCS性質，在分析儀上直接計數CD4和CD8淋巴細胞，并計算比率

以此原理生產的儀器以GEN﹒S細胞分析儀為代表

2、 Bayer公司的光散射與細胞化學聯合技術以ADVIA120為代表的此類儀器聯合應用激光散射與過氧化物酶染色技術進行白細胞分類計數

用激光散射技術計數血細胞，因細胞表面結構不同，在不同角度上所測散射光會有所差別

此儀器有四個測量通道：血紅蛋白測量通道、紅細胞/血小板測量通道、嗜堿性粒細胞測量通道、過氧化物酶測量（白細胞分類）通道

其利用五種白細胞過氧化物酶活性的差異對白細胞進行染色，測定其酶反應強度，對白細胞進行分析

在測試過程中，每個細胞產生兩個信號：組化染色結果與光散射結果

它以X軸代表吸光率（組化染色酶反應強度），Y軸代表光散射（細胞大小），一起定位于細胞圖上（cytogram）見圖二

計算機系統對存儲資料進行分析處理，并結合嗜堿性或分葉細胞通道結果計算出白細胞總數及分類

血液中五種白細胞的過氧化物酶活性排列順序為：嗜酸性粒細胞＞中性粒細胞＞單核細胞

淋巴細胞和嗜堿性粒細胞均無過氧化物酶

將待測血液加入清洗劑和甲醛的等滲液體內經孵育，再加入過氧化氫（H2O2）和四氯－萘酚，細胞內過氧化酶分解產生〔O〕－，使四氯－萘酚顯色并沉淀，并定位于酶反應部位

由于酶反應強度不同，激光束照射細胞在低角度（0°－5°）和高角度（5°－14°）測定散射強度也不同

低角度反映細胞大小：由于嗜堿性粒細胞在此溶血劑中保持不溶（細胞大），故散射強；高角度反映核葉數目及大小，核葉多、核圖2、過氧化物酶通道白細胞分類原理圖 大則散射強

最后由計算機綜合處理分析，給出較準確的白細胞總數及分類計數，其中還包括了大型不染色細胞群、即非典型淋巴細胞或過氧化物酶陰性的幼稚細胞，故稱六分類

該儀器采用激光散射法檢測紅細胞和血小板，均需加入試劑；同時還可在紅細胞稀釋液中加入可染RNA的熒光染料，經激光照射激發后，對其中的網織紅細胞進行計數、分類，得到八個網織紅細胞參數

由于其采用化學染色方法來分析細胞類別，故其共使用了11種試劑來進行測試，運行成本較高

3、 雅培（Abbott）公司采用的多角度偏振光散射（MAPSS）技術以CD-3500和CD-3000型血細胞分析儀為代表的此類儀器采用了多角度偏振光散射技術進行白細胞分類計數

其原理是利用鞘流液與血標本按適當的比例混合后，使其白細胞內部結構基本保持不變（只有堿性粒細胞顆粒因有吸濕特性而其結構有較微改變），紅細胞在該鞘流液中細胞膜完整且和鞘流液的吸光指數相等，故不會干擾白細胞的檢測

用偏振激光束射照單個排列細胞（集中于一直徑30um的小股液流中），并進一步分辨細胞

該技術采用了其他儀器很少用的10°窄角和偏振加消偏振檢測法，分辨能力有所提高

它第一步先測試中性/單核細胞，用0°－90°的散射數據，再測90°D的衍射差，將嗜酸性和中性細胞分開，而嗜堿性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞，則按其大小和內部結構的復雜性不同，所產生的散射光也各異，用可調較的門限加以區分

其采用特定程序自動儲存分析數據，并經電腦軟件處理，在屏幕上顯示6個散點圖和兩個直方圖

4、Sysmex公司的射頻（RF）加直流阻抗式（DC）的白細胞分類技術典型機型如SysmexSE-9000/SE-9500/XE-2100等

這類儀器共有四個不同的檢測系統，將標本用特殊細胞染色技術處理后再應用RF和DC技術對白細胞進行分類和計數

其共采用如下四個檢測系統：1) 淋巴、單核、粒細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞）檢測系統：該系統采用電阻抗與射頻聯合檢測方式，使用作用較溫和的溶血劑，對核及細胞型態影響不大

在內外電極上存在直流和高頻兩個發射器

由于直流電不能達到細胞質及核質，而射頻電能透入胞內測量核大小和顆粒多少，因此這兩種不同的脈沖信號的個數及高低綜合反映了細胞數量、大小（DC）和核及顆粒密度（RF）

由于淋巴細胞、單核細胞及粒細胞的大小、細胞質含量、核形態與密度均有較大差異，故可通過掃描得出其比例

2) 嗜酸性粒細胞檢測系統：該系統是利用電阻抗方式計數

血液經分血器分血后部分與嗜酸性粒細胞計數溶血劑混合，特異的溶血劑使嗜酸性粒細胞以外的所有細胞均溶解或萎縮，這種含完整嗜酸性粒細胞的液體經阻抗電路計數

3) 嗜堿性粒細胞系統：該系統檢測原理與嗜酸性粒細胞相同，不同的是其溶血劑只能保留血液中的嗜堿性粒細胞

4) 幼稚細胞檢測系統：該系統也是利用電阻抗方式計數

其原理是由于幼稚細胞上的脂質較成熟細胞少，在細胞懸液中加入硫化氨基酸后，由于脂質占位不同，結合在幼稚細胞上的硫化氨基酸較成熟細胞多，且對溶血劑有抵抗作用，故能保持幼稚細胞的形態完整而溶解成熟細胞，即可通過阻抗法檢測

四、網織紅細胞計數 網織紅細胞（簡稱網紅）計數是反映骨髓造血功能的重要指標

迄今國內仍多采用顯微鏡目測法，由于受主觀影響，其計數精度較差

20世紀90年代初，日本SYSMEX公司首先推出R-1000網紅細胞分析儀，開始用分析儀代替目測法，無論從實驗方法還是臨床應用，均取得了良好的效果

網紅細胞是晚幼紅細胞脫核后到完全成熟紅細胞之間的過渡細胞，由于其胞漿中殘存嗜堿性物質，在活體可被藍染成藍色細顆粒或網狀物而得名<

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