04 化療后網織紅細胞百比值高(左歸丸簡介)

血病和一些疑難性疾病[7]。FCM通過對人白細胞抗原(HLA)配型的測定可以為異體干細胞移植病人選擇出最合適的供體。造血干細胞移植技術主要包括干細胞的鑒別、活性測定、干細胞動員和采集、分離純化、保存擴增、腫瘤細胞的凈化、干細胞回輸以及術后保持移植物抗宿主病的低發生率等一系列過程。FCM測定CD34、HLA-DR、CD33等細胞表面標志物，成為干細胞移植技術重要的監測手段。用FCM檢測一系列指標觀察病人的恢復狀態，可以對預后做出早期的判斷。

(2)其它種類血液病的診斷和治療監測：陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥是一種造血干細胞克隆病，細胞CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。該抗原屬于血細胞表面磷脂酰肌醇錨連蛋白家族，是重要的補體調節蛋白，它通過與補體C8、C9的結合以阻止補體膜攻擊復合物的形成，從而抑制細胞被補體激活溶解。FCM采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞CD59的表達做定量分析，可以協助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度[8]。

(3)網織紅細胞的測定及臨床應用：網織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標，FCM通過某些熒光染料(吖啶橙、噻唑橙等)與紅細胞中RNA結合，定量測定網織紅細胞中RNA，得到網織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。有作者報道FCM方法比目測法結果精確度更高[9]。此外FCM還可以測量出網織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義[10]。為干細胞移植術后恢復的判斷、貧血的治療監測、腫瘤病人放化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據。

在血栓與出血性疾病中的應用

(1)血小板功能的測定：正常情況下血小板以分散狀態在血管內運行，但當血管損傷、血流改變或受到化學物質刺激時血小板被活化而發生一系列改變。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達水平的高低來判斷，FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況成為檢查血小板功能的一種新手段[11]。該方法靈敏、特異性高。如果采用全血法測定，只需微量標本，適合于兒童及血小板減少性疾病的患者[12]。 血小板活化時其質膜糖蛋白較其靜止期發生顯著改變，FCM可以通過單抗免疫熒光標記(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)監測血小板功能及活化情況，有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療。

此外血小板活化時其細胞內的鈣離子濃度發生很大變化，借助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監測的非免疫性指標。(2)血小板相關抗體的測定：免疫性血小板減少性紫癜病人血漿中可產生血小板自身抗體，結合在血小板表面，稱為血小板相關抗體，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標記被測血小板，FCM可以測定血小板相關抗體含量。直接法檢測血小板表面的相關抗體，間接法可測定血清中的相關抗體。該方法用于該病的診斷及治療監測，具有檢測速度快、靈敏度高的優點。

質量控制

一、流式細胞儀的校準

流式細胞儀的校準包括流路的穩定性、光路的穩定性、多色標記熒光顏色補償、光電倍增管轉換的線性和穩定性。對儀器的校準主要是利用標準微球進行監測。聚苯乙烯可以被做成各種大小的微球，也可被熒光標記或者擁有定量免疫球蛋白的結合位點。這種制成固定熒光強度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成為流式質控中的一個常用的標準品。

二、實驗操作過程的質控

1、樣本的質量控制

用于流式分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、組織活檢物、漿膜腔積液、腦脊液、皮膚、黏膜（內窺鏡活檢物）、細針穿刺物等等。樣本的條件控制可能是免疫表型分析質控最困難的環節之一。每種樣本都有不同的采集、保存、運輸和制備要求。首先，觀測樣本外觀：有嚴重溶血、凝聚或壞死的樣本應棄用。

第二，單細胞懸液的獲取：外周血和骨髓穿刺液為天然單細胞懸液；活檢組織常用機械分離和酶消化兩種方法。不同的實驗要求適用不同的方法。對于需要進行膜抗原標記的，不僅是要獲得足夠的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結構的完整性和抗原性，機械法較適用。只需進行細胞周期或DNA倍體分析的，在機械法的基礎上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）較適用。

第三，抗凝劑的選擇：外周血標本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標本做白細胞計數和流式分析，則應用EDTA抗凝；對于血小板分析的實驗，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細胞活性問題，通常不推薦用ACD作骨髓穿刺液的抗凝劑。

第四，樣本的保存：理想狀態下，樣本應在采集后立刻進行處理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時/室溫（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小時/室溫（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小時/室溫（16-25）；對于只作胞內染色的樣本，可固定細胞以長期保存。但此“固定－染色”的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式。

第五，去除紅細胞的方法：紅細胞裂解法，操作簡單、快、并最可能保持原始標本的白細胞分布。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認：（1）抗原性不被溶血過程改變；（2）溶血劑被徹底洗去，細胞和抗體結合的動力反應未受影響；（3）所用溶血劑不含固定劑，否則會影響細胞活性及表面標記結果。密度梯度離心法，靶細胞回收較好并可能得到富集，同時去除紅細胞、碎片等，但費時，某些重要細胞群體可能被選擇性丟失。

第六，細胞與抗體的比例：廠家推薦的抗體用量通常是假定靶細胞數量在5X105 ~1x106范圍內。有些標本沒有足夠的細胞，有些則由于細胞量大，正常濃度下的抗體相對過量或不足，導致假陽性或假陰性結果。因此，每個實驗室應根據不同于廠家推薦的方法，調整細胞與抗體用量，得到最適的細胞/抗體比例。

第七，細胞活性的鑒定：死細胞對許多抗體均有很強的非特異性染色，這就使樣本細胞活性檢測變得非常重要，尤其是經過了長時間運輸和儲存的樣本。檢測的方法通常有兩種：（1）實時的流式檢測：利用熒光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放線菌素D（7-AAD）或EMA（ethidium monoacide）進行死細胞染色，而活細胞拒染這些染料。此方法的優勢是細胞表面標志和活性分析可同時進行。尤其適用于高度壞死的樣本。7-AAD最常用，因為在488nm激發下，其最大發射光在670nm左右，適合與FITC 或PE進行多色標記。但隨著時間延長，7AAD會在固定的細胞群體重新分配，死活細胞的區分變得困難。因此，對于染色并在固定后12小時以上分析的標本，最好用EMA。EMA與死細胞DNA穩定的共價結合保證了長時間固定后仍能很好地區分固定前的死活狀態。（2）手工檢測：使用Trypan blue 或其他細胞活性染料。（3）使用專門的儀器進行檢測。如Vi-cell.

2、選擇和確定單抗組合

流式分析最基本的試劑就是抗體。所選抗體的好壞直接影響結果。影響抗體特性的因素很多，如F/P比值、亞型、全長或片段、種宿來源、標記熒光種類等等。而且，有CD分類號的300多種單抗和大量沒有CD分類號的單抗使抗體的選擇更加困難。一般，選擇抗體組合遵循以下基本原則：1）所選的抗體組合應足夠寬，可以鑒別樣本中的所有細胞亞群包括正常和異常群體。2）對表達少的抗原應盡可能選擇熒光強度強的熒光素標記。3）了解不同抗體的細胞反應譜，以及染色模式。根據不同的實驗目的選擇抗體。因為相同CD編號的抗體可能識別不同的抗原決定簇。4）抗體的多種組合可能相互影響與抗原的結合（如通過空間構型的阻礙），所以對所用抗體組合，應先了解每個抗體在對照細胞上單色標記的表達情況。5）對于臨床實驗盡量選擇體外診斷（IVD）試劑和分析特異性（ASR）試劑，而僅供研究用（RUO）試劑一般不能用于體外診斷實驗。在我國，用于體外診斷的試劑還必須取得國內的SDA認證。這樣，一個抗體組合內的抗體可能來源不同的公司，有不同的濃度、不同的亞型、不同F/P值，可能均需要自身的同型對照，而實際上，這是非常困難的。那么，盡量選擇同一家公司的試劑可以減少上述的干擾。對于臨床上常見的流式檢測項目，所需的試劑組合基本都有參考或推薦的抗體組合。

如，T細胞亞群檢測的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；陣發性血紅蛋白尿（PNH）檢測的CD55、CD59；血小板無力癥（GT）檢測的CD41、CD61等等。但對于白血病/淋巴瘤免疫分型，國際上迄今為止也沒有統一的抗體組合。在2000年國際細胞分析學會（ISAC）大會上，臨床血細胞計數協會組織了一次國際專家會議，以期對檢測血液淋巴系統腫瘤所需最少、最有效的單抗數達成共識。75%與會者一致認為，對于慢性淋巴系統增殖性疾病（CLD）有9種單抗：CD5,CD19, κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45對初診來說是最基本的。淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16種單抗。對于急性白血病（AL），75%的與會者認為大約13-15種單抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，對初步鑒別白血病系列是必需的。其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能對某些病例有用。幾乎所有的投票者都認為，要對急性白血病完善分類所需單抗的恰當數量平均為20-24種。但這些抗體之間組合也是一大難題，目前也無統一規定（如表二）。大會多數發言者(11/13)指出，對已確診病人的監護和分期來說，僅需較少單抗。

抗體的質量控制是實驗的關鍵環節。抗體的質量包括其特異性、靈敏度、精密度。對這一些，一些商業化的公司對常用單抗的檢驗均推出了一系列質控物。如BECKMAN COULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等（見表一）。

3、染色方法

細胞表面染色：大多數免疫表型分析均采用此方法。但由于許多抗原也同時存在細胞內，所以在細胞表面抗原檢測時應特別注意保持細胞膜的完整以保證檢測的特異性。表面標記又分溶血前標記和溶血后標記。若紅細胞對標記有影響或血漿成分對標記有影響的，適合溶血后標記，但要注意溶血劑膜抗原的影響，所以，溶血劑一般不含固定劑。如免疫球蛋白輕鏈檢測和陣發性血紅蛋白尿的檢測等。

細胞內染色：有些胞內抗原的檢測對白血病的免疫分型尤為重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD79a 。胞內染色的關鍵是使細胞膜通透，把抗體或核酸染料導入胞內而不影響細胞骨架的完整性。還要保證固定和透膜的步驟不影響有關抗原與相應抗體的結合力和核酸與染料的結合。某些適用于胞內染色的試劑可能不適于表面標記分析。通常胞內染色不能與細胞活性的檢測同時進行，除非用EMA的方法。對于胞內染色，所用的熒光素應足夠小到能穿透到胞膜內。對于某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）為活細胞染料，無需固定或透膜。

胞膜和胞內染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內染色，最后是DNA染色。

三、數據的獲取和分析

流式細胞儀數據的獲取必須是在儀器性能的校準均合格的基礎上進行。由于流式細胞儀是基于對散射光信號和熒光信號進行分析的儀器，因此，儀器散射光和熒光信號的光電倍增管電壓、增益、顏色補償等參數的設定直接影響結果。同型對照的設定尤為重要。同型對照是指與單抗種宿來源相同、亞型相同、標記熒光素相同的未免疫動物的免疫球蛋白。同時考慮濃度、F/P值盡量相同，這樣陽性閾值的界定才比較準確，特別是對于弱表達抗原陽性率的測定。而DNA倍體

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