04 網織紅細胞計數手工法步驟(實用檢驗醫學的圖書目錄)

二、Miller窺盤計數技術

三、網織紅細胞計數測定參考方法

四、參考值

五、臨床意義

第八節 白細胞計數技術

一、方法學

二、方法學評價

三、白細胞計數參考方法

四、參考值

五、臨床意義

第九節 白細胞分類計數和形態檢查技術

一、方法學

二、方法學評價

三、白細胞分類計數參考方法

四、參考值

五、臨床意義

第十四章 造血細胞和造血組織形態學檢驗技術

第一節 造血形態學檢驗項目優化組合及其結合

第十五章 貧血檢驗技術

第十六章 止血與血栓檢驗技術

第十七章 輸血相關檢驗技術

第十八章 尿液分析技術

第十九章 體液檢驗技術

第二十章 脫落系統學檢驗技術

第二十一章男性生殖病檢驗技術

第二十二章女性生殖病檢驗技術

第二十三章圍產期保健檢驗技術

第二十四章細胞遺傳學檢驗技術

第二十五章床旁檢驗技術

第二篇 臨床生物化學與分子檢驗技術篇

第三篇 臨床免疫檢驗技術篇

第四篇 臨床微生物檢驗技術篇

中文索引

英文索引

附錄 血液尿液細胞形態

流式細胞術的應用范圍

隨著對FCM研究的日益深入，其價值已經從科學研究走入了臨床應用 階段，在我國臨床醫學領域里已有著廣泛的應用。可用于白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定，以及免疫學研究，并已開始用于細菌鑒定，病毒感染細胞的識別和艾滋病感染者T4、T8細胞的記數。

自70年代以來，隨著流式細胞技術水平的不斷提高，其應用范圍也日益廣泛。流式細胞術已普遍應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫學和基礎醫學研究領域。

在腫瘤學中的應用

這是FCM在臨床醫學中應用最早的一個領域。首先需要把實體瘤組織解聚、分散制備成單細胞懸液，用熒光染料(碘化吡啶PI)染色后對細胞的DNA含量進行分析，將不易區分的群體細胞分成三個亞群(G1期，S期和G2期)，DNA含量直接代表細胞的倍體狀態，非倍體細胞與腫瘤惡性程度有關。

(1)發現癌前病變，協助腫瘤早期診斷：人體正常組織發生癌變要經過一個由量變到質變的漫長過程，而癌前細胞即處于量變過程中向癌細胞轉化階段。人體正常的體細胞均具有比較穩定的DNA二倍體含量。當人體發生癌變或具有惡性潛能的癌前病變時，在其發生、發展過程中可伴隨細胞DNA含量的異常改變，FCM可精確定量DNA含量的改變，作為診斷癌前病變發展至癌變中的一個有價值的標志，能對癌前病變的性質及發展趨勢作出估價，有助于癌變的早期診斷。有資料證實，癌前病變的癌變發生率與細胞不典型增生程度有密切關系，增生程度越重，癌變發生率越高。隨著細胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍體出現率增高，這是癌變的一個重要標志。

(2)在腫瘤的診斷、預后判斷和治療中的作用：FCM在腫瘤診斷中的重要作用已經被認可，DNA非整倍體細胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力的依據，FCM分析病理細胞具有速度快、信息量大，敏感度高等優點，已被用在常規工作中。腫瘤細胞DNA倍體分析對病人預后的判斷有重要作用，異倍體腫瘤惡性病變的復發率高、轉移率高、死亡率也高，而二倍體及近二倍體腫瘤的預后則較好。

FCM不僅可對惡性腫瘤DNA含量進行分析，還可根據化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評估療效，了解細胞動力學變化，對腫瘤化療具有重要的意義。臨床醫師可以根據細胞周期各時相的分布情況，依據化療藥物對細胞動力學的干擾理論，設計最佳的治療方案，從DNA直方圖直接地看到瘤細胞的殺傷變化，及時選用有效的藥物，對瘤細胞達到最大的殺傷效果。

此外FCM近幾年還被應用于細胞凋亡和多藥耐藥基因的研究中[3，4]。醫學工作者開始研究如何用藥物誘導癌細胞死亡。通過對細胞體積、光散射、DNA含量及特異性抗原基因(如bcl-2, Fas等)測定分析出細胞凋亡情況。多藥耐藥是腫瘤病人化療失敗的主要原因，FCM對多藥耐藥基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達的測定，可為臨床治療效果分析提供有力依據。

在臨床中的作用

FCM通過熒光抗原抗體檢測技術對細胞表面抗原分析，進行細胞分類和亞群分析。這一技術對于人體細胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治療有重要作用。有大量文章介紹了淋巴細胞亞群等在各種疾病中的變化。正常人群淋巴細胞T4/T8比值大約為2∶1，但在人體細胞免疫力低下時可出現比例倒置。用FCM還可以監測腎移植后病人的腎排斥反應，如果T4/T8比例倒置，病人預后良好，較少發生腎排異現象；反之排異危險性增加。同樣此種測定技術也用于艾滋病的診斷和治療中。還有作者報告了外周血淋巴細胞免疫表型的參考值，并對其種族、性別、年齡等影響因素進行了探討[5]。

目前FCM用的各種單克隆抗體試劑已經發展到了百余種，可以對各種血細胞和組織細胞的表型進行測定分析。

在血液病診斷和治療中的應用

FCM通過對外周血細胞或骨髓細胞表面抗原和DNA的檢測分析，對各種血液病的診斷、預后判斷和治療起著舉足輕重的作用。

(1)白血病的診斷和治療：FCM采用各種抗血細胞表面分化抗原(CD)的單克隆抗體，借助于各種熒光染料(異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等)測定一個細胞的多種參數，以正確地判斷出該細胞的屬性。各種血細胞系統都具有其獨特的抗原，當形態學檢查難以區別時，免疫表型參數對各種急性白血病的診斷和鑒別診斷有決定性作用[6]。例如干細胞表達CD34，髓系表達CD13、CD14，B細胞系表達CD10、CD19、CD20等，T細胞系表達CD2、CD3、CD5、CD7，利用FCM可以測定出血細胞表達各種抗原的水平，協助臨床確診。

同其它腫瘤的治療一樣，測定DNA倍體和進行細胞周期分析對指導白血病化療有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病細胞增殖狀況不同，定期了解細胞增殖情況采取相應藥物可以提高療效。

目前臨床除化療藥物治療外還采用造血干細胞移植技術治療急性白血病和一些疑難性疾病[7]。FCM通過對人白細胞抗原(HLA)配型的測定可以為異體干細胞移植病人選擇出最合適的供體。造血干細胞移植技術主要包括干細胞的鑒別、活性測定、干細胞動員和采集、分離純化、保存擴增、腫瘤細胞的凈化、干細胞回輸以及術后保持移植物抗宿主病的低發生率等一系列過程。FCM測定CD34、HLA-DR、CD33等細胞表面標志物，成為干細胞移植技術重要的監測手段。用FCM檢測一系列指標觀察病人的恢復狀態，可以對預后做出早期的判斷。

(2)其它種類血液病的診斷和治療監測：陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥是一種造血干細胞克隆病，細胞CD55、CD59抗原表達減低是該病的一個特點。該抗原屬于血細胞表面磷脂酰肌醇錨連蛋白家族，是重要的補體調節蛋白，它通過與補體C8、C9的結合以阻止補體膜攻擊復合物的形成，從而抑制細胞被補體激活溶解。FCM采用熒光標記的單克隆抗體對血細胞CD59的表達做定量分析，可以協助臨床做出診斷并判斷疾病的嚴重程度[8]。

(3)網織紅細胞的測定及臨床應用：網織紅細胞計數是反映骨髓造血功能的重要指標，FCM通過某些熒光染料(吖啶橙、噻唑橙等)與紅細胞中RNA結合，定量測定網織紅細胞中RNA，得到網織紅細胞占成熟紅細胞的百分比。有作者報道FCM方法比目測法結果精確度更高[9]。此外FCM還可以測量出網織紅細胞的成熟度，對紅細胞增殖能力的判斷很有意義[10]。為干細胞移植術后恢復的判斷、貧血的治療監測、腫瘤病人放化療對骨髓的抑制狀況等提供了依據。

在血栓與出血性疾病中的應用

(1)血小板功能的測定：正常情況下血小板以分散狀態在血管內運行，但當血管損傷、血流改變或受到化學物質刺激時血小板被活化而發生一系列改變。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達水平的高低來判斷，FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況成為檢查血小板功能的一種新手段[11]。該方法靈敏、特異性高。如果采用全血法測定，只需微量標本，適合于兒童及血小板減少性疾病的患者[12]。 血小板活化時其質膜糖蛋白較其靜止期發生顯著改變，FCM可以通過單抗免疫熒光標記(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62，CD63等)監測血小板功能及活化情況，有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療。

此外血小板活化時其細胞內的鈣離子濃度發生很大變化，借助于鈣離子敏感熒光探針的幫助，用FCM測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監測的非免疫性指標。(2)血小板相關抗體的測定：免疫性血小板減少性紫癜病人血漿中可產生血小板自身抗體，結合在血小板表面，稱為血小板相關抗體，其分子可以是IgG、IgA或IgM，用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標記被測血小板，FCM可以測定血小板相關抗體含量。直接法檢測血小板表面的相關抗體，間接法可測定血清中的相關抗體。該方法用于該病的診斷及治療監測，具有檢測速度快、靈敏度高的優點。

質量控制

一、流式細胞儀的校準

流式細胞儀的校準包括流路的穩定性、光路的穩定性、多色標記熒光顏色補償、光電倍增管轉換的線性和穩定性。對儀器的校準主要是利用標準微球進行監測。聚苯乙烯可以被做成各種大小的微球，也可被熒光標記或者擁有定量免疫球蛋白的結合位點。這種制成固定熒光強度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成為流式質控中的一個常用的標準品。

二、實驗操作過程的質控

1、樣本的質量控制

用于流式分析的樣本種類很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、組織活檢物、漿膜腔積液、腦脊液、皮膚、黏膜（內窺鏡活檢物）、細針穿刺物等等。樣本的條件控制可能是免疫表型分析質控最困難的環節之一。每種樣本都有不同的采集、保存、運輸和制備要求。首先，觀測樣本外觀：有嚴重溶血、凝聚或壞死的樣本應棄用。

第二，單細胞懸液的獲取：外周血和骨髓穿刺液為天然單細胞懸液；活檢組織常用機械分離和酶消化兩種方法。不同的實驗要求適用不同的方法。對于需要進行膜抗原標記的，不僅是要獲得足夠的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結構的完整性和抗原性，機械法較適用。只需進行細胞周期或DNA倍體分析的，在機械法的基礎上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）較適用。

第三，抗凝劑的選擇：外周血標本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標本做白細胞計數和流式分析，則應用EDTA抗凝；對于血小板分析的實驗，一般不用肝素抗凝。骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細胞活性問題，通常不推薦用ACD作骨髓穿刺液的抗凝劑。

第四，樣本的保存：理想狀態下，樣本應在采集后立刻進行處理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時/室溫（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小時/室溫（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小時/室溫（16-25）；對于只作胞內染色的樣本，可固定細胞以長期保存。但此“固定－染色”的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式。

第五，去除紅細胞的方法：紅細胞裂解法，操作簡單、快、并最可能保持原始標本的白細胞分布。最好在染色后溶血。若在

很赞哦!（3182）