05 網織紅細胞計數流式細胞儀法與儀器法(五分類血球儀白細胞做不出來是什么原因)

的質量控制仍沒有統一的標準， 各文獻報道的實驗結果差異較大，1993年10月美國癌癥研究組織制定了FCMDNA定的統一標準，我們根據這些標準并結合國內有經驗的專家多年的實踐，對FCM的DNA分析技術的質控和注意事項進行說明。

(1) 手術切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時，要避免出血壞死組織。

(2) 標本采集后要及時固定或深低溫保存，以免組織發生自溶，DNA降解，而造成測試結果的誤差。

(3) 固定劑要采用對組織細胞穿透性強的濃度，70%的乙醇固定效果較好。

(4) 單細胞懸液制備過程中，注意將待測細胞成分分離出來，減少其他成分的干擾，并注意不要損傷該群細胞。

(5) 細胞樣品的采集要保證足夠的細胞濃度，即1X106/ml，雜質、碎片、團塊和重疊細胞應<2%，對腫瘤細胞DNA異倍體的分析樣品，至少有20%的腫瘤細胞存在。

(6) 石蠟包埋組織單細胞制備時要注意：取材時應選取無自溶、壞死的組織，對腫瘤組織標本，選取含腫瘤細胞豐富的區域；石蠟組織片的厚度要適宜，最好為40～50μm 。過薄或過厚的切片均會影響檢測結果；徹底脫蠟，以免殘留的石蠟影響酶的消化活性，驗證脫蠟是否完全的方法是棄去二甲苯，加入100%乙醇，如果無絮狀物浮起，說明蠟已脫凈；水化要充分，使組織還原到與新鮮組織相似的狀態；注意消化的時間和消化酶的活性。常規使用0.5%胃蛋白酶，pH 1.5。

9.3 操作

(1)流式細胞儀在整個工作過程中處于最佳狀態，能保證定量檢測的準確性和檢測精度。使用標準樣品調整儀器的變異系數在最小范圍，分辨率在最好狀態，能避免在測量過程中儀器條件的變化引起的檢測誤差。

(2)評價儀器精度的重要指標是儀器的變異系數（CV），對于校準樣品，其CV值越小越好，CV值越小，說明儀器校正的精度越高。校準樣品包括非生物樣品（熒光微球）和生物細胞樣品（人淋巴細胞、雞紅細胞等）。目前，非生物熒光微球已有商品試劑，CV一般<2%～3%。

9.4 資料分析

(1) 當樣品中碎片雜質或團塊過多，所測細胞數在20%以下，組方圖的基線抬高時，應放棄分析處理。

(2) 做細胞周期分析時，樣品細胞數應在1萬個，排除碎片、雜質和團塊，當異倍體細胞數占總細胞數10%以下時，需要結合其他診斷指標，不可盲目下結論，至少異倍體細胞占總細胞數的20%以上，可以確定異倍體的存在。

(3)DNA分析時，正常二倍體細胞組方圖CV值>8%時放棄分析，但腫瘤細胞的CV值>8%，與腫瘤細胞的異質性有關。另外，DNA倍體分析時，同源組織的不同個體會出現10%的漂移。

五分類血球儀白細胞做不出來是什么原因

血細胞分析儀的工作原理及其近期發展姜穗(溫州醫學院附屬第二醫院臨床工程科浙江省 溫州市325027) ［摘要］本文簡要介紹了血細胞分析儀的主要工作原理，各主要廠家在血細胞分析儀上采用的白細胞分類技術及業界的技術進展

［關鍵詞］血細胞分析儀，紅細胞，血小板，白細胞，計數The Work Principle Of Hematology AnalyzerAnd Its Near Period The DevelopmentJiang Sui(Clinical Engineering Department of The Se買粉絲nd Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou Zhejiang ,China)Abstract:Tise paper introces the major principle of hematology analyzer,the categorized technology of white blood cell mainly used by manufacturer and the development of analyzing technology

Keyword: hematology analyzer,red blood cell,platelet,white blood cell,買粉絲unter 自50年代初庫爾特先生發明了粒子計數技術的專利，制造了第一臺血細胞分析儀并應用于臨床以來，血細胞分析儀的發展已有50年的歷史

血細胞分析儀實質上是指對一定體積內血細胞數量及異質性進行分析的儀器

最初的血細胞計數儀（Cell Counter）僅能計數紅細胞（RED）和白細胞(WBC)，后來又有了血紅蛋白（HBG）、血小板(PLT)、紅細胞壓積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）等幾個參數

而發展成為血細胞分析儀（Hematology Analyzer）后，又增加了許多分析和計算參數，如紅細胞體積分布寬度（RDW）、平均血小板體積（MPV）、血小板體積分布寬度(PDW)、血小板壓積(PCT)、大血小板比率、白細胞三分群、白細胞五分類、血紅蛋白濃度分布寬度、異常淋巴細胞提示、幼稚細胞提示等各種參數和功能也不斷地添加到一些品牌的儀器上

電阻檢測法的基本原理是：在待測液體中置一微孔，在微孔的兩端各加一定電壓的電極，當液體中的顆粒巾進經過微孔時，電極間的電阻就會產生訓瞬間的變化，以因而產生電脈沖，對這種電脈沖進行計數就可得到顆粒的數量，脈沖幅度的大小表示顆粒的體積的大小，經過對各種細胞所產生脈沖的大小的電子的選者擇，可以區分出不同種類的細胞；在液體中加上一定的負壓就能使經過微孔的液體流動

隨著電子技術、流式細胞技術、激光技術、電子計算機技術和新熒光化學物質等多種高科技技術在臨床檢驗工作的應用，使血細胞分析儀在自動化程度、先進功能和完美設計方面提高到了一個嶄新的階段，血細胞分析儀已經不僅僅局限在進行常規的血細胞分析，還增加了許多擴展功能，例如將網織紅細胞（RET）的計數和分析功能加入其中，一些儀器還另外增加了幼稚細胞分析和有核紅細胞分析功能，甚至對血液細胞中某些寄生蟲進行提示，更有一些儀器把流式細胞分析儀的某些功能和并到血細胞分析儀上，在進行常規血細胞分析時可得到某些淋巴細胞亞群的分析結果

在常規血細胞計數儀上，紅細胞（RBC）、血小板（PLT）共用一個測量通道，血紅蛋白含量（HGB）的測定在任何類型、檔次的儀器中其測試原理都是相同的

白細胞的計數和分類有其專用的通道，現我們就對分析儀上各測試項目所使用的技術方法和原理作些簡要介紹

一、血紅蛋白含量測定血紅蛋白含量的測定是在被稀釋的血液中加入溶血劑后，使紅細胞釋放出血紅蛋白，后者與溶血劑結合形成血紅蛋白衍生物，進入血紅蛋白測試系統，在特定波長（一般在530-550nm）下比色，吸光度的變化與液體中Hb含量成比例，儀器便可顯示Hb濃度

不同系列的血液分析儀配套溶血劑配方不同，形成的血紅蛋白衍生物也不同，但大多數的最大吸收光譜接近540nm

近年來許多高檔的分析儀上采用了激光散射法進行單個血紅細胞血紅蛋白的分析，以盡量減少高WBC、乳糜血、高膽紅素等對HBG比色的影響

二、血紅細胞及血小板的檢測血紅細胞的檢測是血液分析儀的重要組成部分，紅細胞的檢測以往主要還是使用阻抗法對紅細胞的數目和體積計數，以此分選出不同大小的信號并打印出紅細胞體積分布直方圖

但現在也采用光學和電阻抗法結合的處理方法對紅細胞體積進行三維空間分析（3D）以期得到更正確的結果

如拜爾的ADVIA 120以光散射法檢測紅細胞，以低角度前向光散射和高角度散射兩個測量系統同時測量1個紅細胞，根據低角度光轉換能量的大小測量單個紅細胞體積與總數；根據高角度的光散射得出單個血紅蛋白濃度，可準確得出MCV（平均紅細胞體積）、MCH（平均血紅蛋白含量）、MCHC（平均血紅蛋白濃度）測定值，并繪出紅細胞散射圖，單個紅細胞體積及紅細胞內Hb含量的直方圖及求出RWD（紅細胞體積分布寬度）、HDW（紅細胞血紅蛋白分布寬度）等參數

由于血小板和紅細胞體積的明顯差異，很容易用一個限定閾值將兩者同時測得的光電信號區分

因此，迄今為止全血分析中血小板、紅細胞檢查均采用一個共用的分析系統

但由于血小板和紅細胞測量信號常有交叉，如大血小板的脈沖信號可能被誤認為紅細胞而計數、小紅細胞的脈沖信號可能進入血小板通道，造成實驗誤差

各血細胞分析儀生產廠家采用多種先進技術以減少血小板計數的干擾，以下我們就分別給予介紹：1、掃流技術（sweep flow）：由于血小板和紅細胞在同一個計數池中計數，紅細胞體積較大，在通過正中計數感應區時會形成一個大脈沖，若有回流會同時又產生一個因渦流再度進入感應區邊緣而形成的小脈沖使電極可能感應到相當于血小板大小的小脈沖，使血小板計數假性增多

掃流技術是在進行紅細胞和血小板計數的同時，在紅細胞計數小孔的后面有一個穩定的液流通過，這樣可以使后的紅細胞被立即沖走，以防止回到感應區被計數為血小板

2、防反流裝置：為防止以被計數的紅細胞又回到感應區，在紅細胞計數池小孔的內側按裝一塊帶孔的小板，板上小孔的直徑比紅細胞計數孔略大，正好位于計數孔的后方、感應區以外

當進行細胞計數時，由于負壓的作用細胞快速通過小孔感應區并穿過擋板小孔，即使擋板外側產生渦流，紅細胞也會被阻擋在感應區之外，不影響血小板計數

3、鞘流技術（sheath flow）：為了避免計數中血細胞從小孔邊緣處流過及湍流、渦流的影響，發明了鞘流技術

具體做法是用一毛細管對準小孔管，細胞混懸液從毛細管噴出，同時與四周流出的鞘液一起流過敏感區，保證細胞混懸液在中間形成單個排列的細胞流，四周被鞘液圍繞

鞘流技術可應用于兩種細胞計數原理：一為電阻抗原理，鞘流通過小孔的敏感區進行細胞計數；另一種為激光計數原理，細胞液流室較長，與激光垂直相交，激光光束對流經的每一個細胞照射后產生光散射，利用此原理進行細胞計數

4、浮動界標：正常標本中紅細胞與血小板體積相差較大，一般將紅細胞與血小板的界限定于35fl，大的為紅細胞，小的為血小板，也有以30fl或20fl為界限的

但在某些病理情況下可能有大血小板超過35fl界限，造成血小板漏計使結果偏低；反之，如果紅細胞體積偏小（如缺鐵性貧血、地中海性貧血），則可能將部分小紅細胞誤計為血小板，使血小板計數偏高

為了結果準確一些，計數儀利用計算機在5-35fl間尋找直方圖最低點，以此定為紅細胞和血小板的界限

由此可使所計數的數值符合實際情況

因為各種細胞間的界限可以隨細胞實際大小而向左或右移動，故稱為浮動界標技術（floating threshold）

此外，還有延時計數（extended 買粉絲unt）、擬合曲線（fitting curve）等技術以確保計數結果和體積分布圖的準確性

三、白細胞計數及分類在早期的單分類儀器中，WBC的計數是將病人的血樣經抗凝后按一定比例稀釋，再加入溶血劑（作用是使細胞膜皺縮，周圍的胞漿慢慢從細胞內擴散，但細胞顆粒仍在），使經過這樣預處理的病人血樣成為有懸浮顆粒的液體，并使其在一定時間內流過一個用紅寶石做成的微孔

不同的顆粒可用不同大小的微孔來測試，一般情況下測量白細胞的微孔尺寸長*直徑為100*70微米左右

后來，許多公司在單分類儀

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