08 網織紅細胞血涂片制備(五分類血球儀白細胞做不出來是什么原因)

和溶血劑的作用，使白細胞表面、胞質及細胞大小等特點仍保持與體內相同的狀態，由于不同的細胞在細胞體積、表面特征、內部結構如核漿比例和顆粒構型及質量等方面完全一致的幾率很小，加上儀器配備了先進軟件，可與流式細胞儀一樣調較，設置門限，可在三維圖像上將各細胞較好的分開，達到較準確的分類，同時可提示幼稚白細胞、異型淋巴細胞等

此外，還可將包被了抗CD4和CD8單克隆抗體的聚苯乙烯微球加到血液中，使含有相應表面（抗原）標志的淋巴細胞結合相應的微球而改變該細胞的VCS性質，在分析儀上直接計數CD4和CD8淋巴細胞，并計算比率

以此原理生產的儀器以GEN﹒S細胞分析儀為代表

2、 Bayer公司的光散射與細胞化學聯合技術以ADVIA120為代表的此類儀器聯合應用激光散射與過氧化物酶染色技術進行白細胞分類計數

用激光散射技術計數血細胞，因細胞表面結構不同，在不同角度上所測散射光會有所差別

此儀器有四個測量通道：血紅蛋白測量通道、紅細胞/血小板測量通道、嗜堿性粒細胞測量通道、過氧化物酶測量（白細胞分類）通道

其利用五種白細胞過氧化物酶活性的差異對白細胞進行染色，測定其酶反應強度，對白細胞進行分析

在測試過程中，每個細胞產生兩個信號：組化染色結果與光散射結果

它以X軸代表吸光率（組化染色酶反應強度），Y軸代表光散射（細胞大小），一起定位于細胞圖上（cytogram）見圖二

計算機系統對存儲資料進行分析處理，并結合嗜堿性或分葉細胞通道結果計算出白細胞總數及分類

血液中五種白細胞的過氧化物酶活性排列順序為：嗜酸性粒細胞＞中性粒細胞＞單核細胞

淋巴細胞和嗜堿性粒細胞均無過氧化物酶

將待測血液加入清洗劑和甲醛的等滲液體內經孵育，再加入過氧化氫（H2O2）和四氯－萘酚，細胞內過氧化酶分解產生〔O〕－，使四氯－萘酚顯色并沉淀，并定位于酶反應部位

由于酶反應強度不同，激光束照射細胞在低角度（0°－5°）和高角度（5°－14°）測定散射強度也不同

低角度反映細胞大小：由于嗜堿性粒細胞在此溶血劑中保持不溶（細胞大），故散射強；高角度反映核葉數目及大小，核葉多、核圖2、過氧化物酶通道白細胞分類原理圖 大則散射強

最后由計算機綜合處理分析，給出較準確的白細胞總數及分類計數，其中還包括了大型不染色細胞群、即非典型淋巴細胞或過氧化物酶陰性的幼稚細胞，故稱六分類

該儀器采用激光散射法檢測紅細胞和血小板，均需加入試劑；同時還可在紅細胞稀釋液中加入可染RNA的熒光染料，經激光照射激發后，對其中的網織紅細胞進行計數、分類，得到八個網織紅細胞參數

由于其采用化學染色方法來分析細胞類別，故其共使用了11種試劑來進行測試，運行成本較高

3、 雅培（Abbott）公司采用的多角度偏振光散射（MAPSS）技術以CD-3500和CD-3000型血細胞分析儀為代表的此類儀器采用了多角度偏振光散射技術進行白細胞分類計數

其原理是利用鞘流液與血標本按適當的比例混合后，使其白細胞內部結構基本保持不變（只有堿性粒細胞顆粒因有吸濕特性而其結構有較微改變），紅細胞在該鞘流液中細胞膜完整且和鞘流液的吸光指數相等，故不會干擾白細胞的檢測

用偏振激光束射照單個排列細胞（集中于一直徑30um的小股液流中），并進一步分辨細胞

該技術采用了其他儀器很少用的10°窄角和偏振加消偏振檢測法，分辨能力有所提高

它第一步先測試中性/單核細胞，用0°－90°的散射數據，再測90°D的衍射差，將嗜酸性和中性細胞分開，而嗜堿性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞，則按其大小和內部結構的復雜性不同，所產生的散射光也各異，用可調較的門限加以區分

其采用特定程序自動儲存分析數據，并經電腦軟件處理，在屏幕上顯示6個散點圖和兩個直方圖

4、Sysmex公司的射頻（RF）加直流阻抗式（DC）的白細胞分類技術典型機型如SysmexSE-9000/SE-9500/XE-2100等

這類儀器共有四個不同的檢測系統，將標本用特殊細胞染色技術處理后再應用RF和DC技術對白細胞進行分類和計數

其共采用如下四個檢測系統：1) 淋巴、單核、粒細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞）檢測系統：該系統采用電阻抗與射頻聯合檢測方式，使用作用較溫和的溶血劑，對核及細胞型態影響不大

在內外電極上存在直流和高頻兩個發射器

由于直流電不能達到細胞質及核質，而射頻電能透入胞內測量核大小和顆粒多少，因此這兩種不同的脈沖信號的個數及高低綜合反映了細胞數量、大小（DC）和核及顆粒密度（RF）

由于淋巴細胞、單核細胞及粒細胞的大小、細胞質含量、核形態與密度均有較大差異，故可通過掃描得出其比例

2) 嗜酸性粒細胞檢測系統：該系統是利用電阻抗方式計數

血液經分血器分血后部分與嗜酸性粒細胞計數溶血劑混合，特異的溶血劑使嗜酸性粒細胞以外的所有細胞均溶解或萎縮，這種含完整嗜酸性粒細胞的液體經阻抗電路計數

3) 嗜堿性粒細胞系統：該系統檢測原理與嗜酸性粒細胞相同，不同的是其溶血劑只能保留血液中的嗜堿性粒細胞

4) 幼稚細胞檢測系統：該系統也是利用電阻抗方式計數

其原理是由于幼稚細胞上的脂質較成熟細胞少，在細胞懸液中加入硫化氨基酸后，由于脂質占位不同，結合在幼稚細胞上的硫化氨基酸較成熟細胞多，且對溶血劑有抵抗作用，故能保持幼稚細胞的形態完整而溶解成熟細胞，即可通過阻抗法檢測

四、網織紅細胞計數 網織紅細胞（簡稱網紅）計數是反映骨髓造血功能的重要指標

迄今國內仍多采用顯微鏡目測法，由于受主觀影響，其計數精度較差

20世紀90年代初，日本SYSMEX公司首先推出R-1000網紅細胞分析儀，開始用分析儀代替目測法，無論從實驗方法還是臨床應用，均取得了良好的效果

網紅細胞是晚幼紅細胞脫核后到完全成熟紅細胞之間的過渡細胞，由于其胞漿中殘存嗜堿性物質，在活體可被藍染成藍色細顆粒或網狀物而得名

，在紅細胞的發育過程中，RNA含量有明顯規律性的變化，即由原始階段較為豐富逐漸減低，至細胞完全成熟后消失或接近消失

在流式細胞儀的測量中，一般用某些染料與網紅中RNA結合發出特定顏色的熒光，進行RNA的測定，RNA可精確表示網紅細胞占成熟紅細胞的百分率（RET%）

1993年以來，可進行網紅計數的血細胞分析儀相繼問世，使血細胞分析儀的應用進入了新的階段

Coulter、Abbott、Bayer、Sysmex等眾多廠家的高端機型皆有網紅細胞計數和分析的功能

檢測原理大致以Coulter Maxam和Techni買粉絲n H*3型為代表

Coulter Maxam采用了兩種試劑，一為新亞甲藍著染紅細胞內的RNA，另一為“透明”劑使紅細胞內血紅蛋白溢出，成為“影細胞”減少測試干擾

處理后的血液在儀器上通過VCS原理進行網紅細胞的檢測，可得出RET#、RET%、網紅平均體積（MCVr）和網紅成熟指數（MI）

實驗證明其結果與FCM法高度相關（r＝0

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Techni買粉絲n H*3測試網紅則先將3ul血液加入已標準化的染液中孵育15分鐘，將儀器轉換到網紅計數程序進行檢測，即可得到網紅細胞的實驗參數

包括RET#、RET%、MCVr、RDWr（網紅體積分布寬度）、CHr（網紅內血紅蛋白量）、HDWr（網紅內血紅蛋白分布寬度）及網紅細胞分類

根據熒光強度，可將網紅細胞分成低（LFR）、中(MFR)、高(HFR)三部分

幼稚的網紅顯示最強的熒光，反之成熟紅細胞極少或沒有熒光

綜上所述，由于近年來綜合性高科技的飛速發展，血細胞分析儀上也不斷采用最新的電子、光學、化學和計算機技術，從而不斷滿足臨床工作對血細胞分析的要求，各廠家朝著高速度、多參數、多功能合成及操作更靈活和方便上發展，近期各廠家更是推出了血液分析儀的全自動流水線化，將血液常規分析、網織紅細胞分析、血片的制備（選擇、涂片、編號、染色、干燥）等系列步驟通過儀器自動完成

血液先經血細胞分析儀檢測，根據紅細胞情況決定是否作網紅計數，根據HCT改變涂片機的角度和速度，以保證合格的血涂片

根據實驗數據和直方圖的變化，計算機選擇是否需要進一步的顯微鏡檢查，特別是自動加樣系統和真空采血管的應用，不但可能避免實驗的隨機誤差，加快標本的處理速度，而且避免了某些實驗環節造成的血行感染，對工作人員的勞動保護起了關鍵作用，同時使許多操作更加的標準化，成為儀器使用和發展的潮流

參考文獻：1、許文融，谷俊俠主編，《臨床血液學檢驗》，南京：東南大學出版社出版2、叢玉隆等主編，《血細胞分析技術與臨床》，天津：天津科學技術出版社3、王淑娟等主編，《現代血細胞學圖譜》，人民衛生出版社4、 拜爾公司《拜爾診斷》5、 BECKMAN COULTER公司及Sysmex公司等產品通訊

臨床檢驗基礎的圖書目錄

第一篇血液檢驗

第一章血液標本采集與處理

第一節血液標本采集

一、血液標本的類型

二、血液標本的采集方法

第二節血液標本處理

一、血液標本添加劑的選擇

二、血液標本的保存與運送

三、血液標本檢驗前的預處理

四、血液標本檢驗后的處理

第二章血細胞手工檢驗

第一節外周血液血細胞形態學檢驗

一、血涂片制備與染色

二、紅細胞形態檢查

三、白細胞形態檢查

四、血小板形態檢查

第二節紅細胞檢驗

一、紅細胞計數

二、血紅蛋白測定

三、血細胞比容測定

四、紅細胞平均值

五、網織紅細胞計數

六、嗜堿性點彩紅細胞計數

七、紅細胞沉降率測定

第三節白細胞檢驗

一、白細胞計數

二、白細胞分類計數

三、嗜酸粒細胞計數

第四節血小板檢驗

第三章血細胞分析儀檢驗

第一節血細胞分析儀檢驗原理

一、血細胞計數原理

二、白細胞分類(群)計數原理

三、血紅蛋白檢測原理

四、血細胞分析儀工作流程

五、方法學評價

第二節血細胞分析儀檢驗參數及臨床應用

一、檢驗參數

二、臨床應用

第三節血細胞分析儀檢驗圖形及臨床應用

一、血細胞直方圖及臨床應用

二、血細胞散點圖及臨床應用

第四節血細胞分析儀性能評價與全面質量控制

一、性能評價

二、全面質量控制

第四章血型檢驗

第一節紅細胞血型系統

一、ABO血型系統

二、Rh血型系統

三、紅細胞其他血型系統

第二節血型鑒定和交叉配血

一、ABO血型鑒定

二、Rh血型鑒定

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